Вісник НАН України. 2017. № 7.44-52
https://doi.org/10.15407/visn2017.07.044
ПЕТРУШКО Марина Павлівна —
доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу кріобіології системи репродукції лабораторії кріоконсервування гамет та ембріонів Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
СУЧАСНИЙ СТАН ПРОБЛЕМИ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ РЕПРОДУКТИВНИХ КЛІТИН ТА ЕМБРІОНІВ ЛЮДИНИ
За матеріалами наукової доповіді на засіданні Президії НАН України 17 травня 2017 року
У доповіді наведено результати досліджень з кріоконсервування гамет та ембріонів, які є основою для допоміжних репродуктивних технологій, що стрімко розвиваються протягом останнього десятиліття. Розкрито сучасний стан проблеми кріоконсервування репродуктивних клітин, визначено основні методи заморожування-відігріву, їх переваги та недоліки; з’ясовано фактори, які впливають на результативність кріоконсервування та безпеку цих процедур для нащадків. Основний акцент зроблено на вивченні впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні характеристики гамет та доімплантаційних ембріонів людини (у клінічній медицині та в експериментальних дослідженнях).
Ключові слова: кріоконсервування, репродуктивні клітини, доімплантаційні ембріони.
Вступ. В останні десятиліття в Україні спостерігається тенденція до депопуляції, що спричинено, зокрема, падінням народжуваності. Сприяти поліпшенню демографічної ситуації може вирішення проблеми безплідного шлюбу, який становить до 15% від загальної кількості подружніх пар репродуктивного віку [1].
Кріоконсервування гамет і ембріонів є важливим аспектом допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), які зараз стрімко розвиваються у світі. В Україні перша дитина після зачаття in vitro народилася в 1991 р. у Харкові. Це стало можливим завдяки злагодженій роботі команди професіоналів з Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (рис. 1).
Упровадження технологій кріоконсервування підвищило ефективність лікування безпліддя та кумулятивну частоту настання вагітності в лікувальних циклах, забезпечило біологічну безпеку використання донорських гамет та ембріонів шляхом дотримання карантину [2].
Науково-технічний прогрес у біології та медицині і насамперед розвиток репродуктивної кріобіології дають змогу на практиці забезпечити високу якість заморожено-відігрітих гамет і ембріонів для збереження генофонду сім’ї та народження здорових нащадків [3].
Базові принципи кріоконсервування. Створенню способів кріоконсервування гамет і ембріонів людини передував цикл теоретичних та експериментальних досліджень, проведених як представниками зарубіжних шкіл (Mazur, Leibo, Whittingham), так і харківською школою кріобіологів (М.С. Пушкар, В.І. Грищенко, Ф.І. Осташко, А.М. Білоус) і присвячених вивченню проникності цитоплазматичної мембрани клітин для води, іонів, кріопротекторів. Це дозволило обґрунтувати склад кріоконсервантів, способи їх додавання до біооб’єктів, параметри еквілібрації, режиму охолодження та відігріву [4, 5].
Досягнення в галузі кріоконсервування репродуктивних клітин та ембріонів пов’язані з відкриттям і подальшим розвитком уявлень про захисні речовини — кріопротектори. До кріопротекторів належать компоненти синтетичних середовищ, які відіграють роль стабілізаторів води та сприяють запобіганню або зменшенню змін, що настають при заморожуванні біологічних об’єктів.
Відповідно до характеру взаємодії з біологічними об’єктами, кріопротектори поділяють на ендоцелюлярні (ДМСО, 1,2-пропандіол, етиленгліколь, гліцерин) та екзоцелюлярні (сахароза, глюкоза, амід, фікол, протеїни та ліпопротеїни). Ендоцелюлярні, або проникаючі, кріопротектори знижують точку замерзання розчину, взаємодіють з мембранними структурами клітини, запобігають високій концентрації внутрішньо- та позаклітинних електролітів [6].
Непроникаючі кріопротектори збільшують осмотичний градієнт, завдяки якому відбувається дегідратація клітини перед процедурою охолодження. Крім того, механізм дії екзоцелюлярних кріопротекторів пояснюється здатністю зв’язування значної частини вільної води та зменшенням пошкоджень кристалами льоду.
На сьогодні немає єдиної думки щодо вибору кріопротекторів. Цікавим є той факт, що біооб’єкти проявляють різну кріорезистентність під час застосування різних кріопротекторів.
Є кілька основних способів глибокого заморожування: повільне, швидке охолодження та надшвидке (методом вітрифікації). Швидкість охолодження залежить від складу і проникності клітинної мембрани для води, співвідношення об’єму клітини і площі її поверхні та від різниці осмотичного тиску по обидва боки мембрани.
Стандартним методом кріоконсервування гамет та ембріонів людини залишається метод повільного охолодження за спеціальними програмами з використанням, як правило, проникаючих кріопротекторів.
Для життєдіяльності кріоконсервованих біооб’єктів не менш важливим є процес відтавання. Переважно використовують швидке відігрівання, оскільки в разі повільного відігрівання може розвинутися внутрішньоклітинна рекристалізація.
Наступним важливим етапом є видалення кріопротекторів, що досягається поступовим переміщенням гамет та ембріонів у розчини кріопротекторів зі зниженою концентрацією.
Залежно від інтенсивності ураження, його тривалості та характеру доля клітини може бути різною. У результаті ушкодження клітини можуть адаптуватися до фактора ушкодження, репарувати його, реактивувати після зняття впливу або необоротно змінитися і загинути. Розвиток процесу ушкодження клітин може зупинитися після закінчення несприятливого впливу. Якщо зміни в клітині не зайшли надто далеко, відбувається репарація клітинних ушкоджень, повернення клітини до нормального функціонального рівня.
Великі надії зараз покладають на метод надшвидкого заморожування. Цей метод потребує високих концентрацій добре проникаючих крізь мембрану кріопротекторів у поєднанні з малопроникаючими.
Загалом до способів кріоконсервування ставлять кілька принципових вимог: доступність, простота, висока ефективність, швидкість, безпека.
Кріоконсервування сперматозоїдів. На сьогодні спостерігається зростання чоловічого фактора безпліддя — до 50% безплідних шлюбів. Кріоконсервування сперміїв і розвиток допоміжних репродуктивних технологій допоможуть вирішити безліч проблем, пов’язаних із чоловічим безпліддям. Однак у багатьох випадках необхідне поліпшення методик кріоконсервування для підвищення якісних характеристик розмороженої сперми. Кріоконсервування спрямоване на збереження сперми й отримання після заморожування-відігріву еякуляту з властивостями, максимально наближеними до нативної сперми. При цьому структурно-функціональний стан сперміїв залежить від вибору режиму кріоконсервування та виду кріопротекторів.
Застосування збереженої за допомогою кріоконсервування сперми показане при лікуванні безпліддя у випадках майбутньої контрацептивної вазектомії, хіміотерапії, пацієнтам з онкологічними захворюваннями, для відтермінування лікувальних процедур, як профілактичний захід при плануванні сім’ї, з метою донорства. Кріоконсервування допомагає вирішити проблему збереження невеликої кількості одиничних сперматозоїдів, отриманих при біопсії яєчка або придатка яєчка (TESA, PESA) та мікрохірургічній аспірації сперматозоїдів із придатка яєчка (MESA).
За даними ВООЗ, якість сперми у чоловіків погіршується щороку, тому необхідні методи, які дозволяють підвищувати якість кріоконсервованої сперми. До найтяжчих причин чоловічого безпліддя належать олігоастенотератозооспермія та азооспермія. За даними різних авторів, цей стан може бути виявлено у 10% безплідних пацієнтів.